일반적인 PCR의 검사 효율을 최적화하려면 반응 체계와 유인물 설계를 최적화하는 것 외에 증폭 프로그램의 정밀화 조정에 주목해야 한다.몇 가지 주요 전략은 다음과 같습니다.

1.경도 PCR 최적 퇴화 온도 결정
해열 온도는 특이성을 증폭시키는 데 매우 중요하다.50 ° C-65 ° C의 그라데이션을 설정하는 것과 같은 그라데이션 PCR을 통해 퇴화 온도를 신속하게 필터링하여 비특이성 스트라이프 또는 증폭 실패를 방지할 수 있습니다.만약 유인물 Tm 값의 차이가 비교적 크다면,"Touchdown PCR"을 시도할 수 있다. 즉 높은 온도에서 퇴화 온도를 점차 낮추고, 고특이성 산물을 우선적으로 증폭시킬 수 있다.

2. 순환 매개변수 최적화
- 사전 변성 시간: 높은 GC 함량의 템플릿의 경우 초기 변성을 5-10 분까지 연장하여 DNA 체인 해제를 보장 할 수 있습니다.
- 연장시간: 증폭 세그먼트 길이에 따라 조정(일반적으로 1kb/분으로 계산)하되 효소 활성 차이에 유의해야 한다.예를 들어, 고화질 효소는 더 오래 걸릴 수 있습니다.
- 루프 수: 일반적인 증가는 25-35 루프를 권장합니다.너무 많은 순환은 템플릿을 희석하거나 순환 수의 균형 감도와 특이성을 감소시키는 유인물 폴리머 위험을 증가시킵니다.

3. 첨가제 사용
- DMSO 또는 사탕무 알칼리: 복잡한 2단계 구조의 영향을 완화하며, 특히 긴 조각 또는 높은 GC 템플릿에 적용됩니다(종종 농도 3~5% 권장).
- Mg²⁺ 농도 최적화: Mg²⁺ 는 Taq 효소의 보조 인자로서 그 농도 (일반적으로 1.5-2.5mM) 는 dNTPs와 균형을 맞춰야 한다.0.5mM 간격의 그라데이션 실험을 통해 최적 농도를 결정할 수 있습니다.

4. 템플릿 품질 및 양
억제물을 포함하거나 분해된 템플릿을 사용하지 마십시오.샘플이 환경 DNA인 경우 기둥 순화와 같은 사전 처리 단계를 추가할 수 있습니다.템플릿 양은 1-100ng 사이가 권장되며, 너무 많으면 비특이성 증폭을 초래할 수 있고, 너무 적으면 순환 수를 증가시켜야 한다.

5. 대조 설정
시약 오염이나 시스템 이상을 제거하기 위해 양성 대조 (알려진 템플릿), 음성 대조 (템플릿 없음) 및 내부 대조 (예: 집사 유전자) 가 포함됩니다.