1. ELISA의 원리

ELISA는 항원이나 항체의 고상화 및 항원이나 항체의 효소 표시가 기본이다.고상담체 표면에 결합된 항원이나 항체는 여전히 그 면역학적 활성을 유지하며, 효소가 표시된 항원이나 항체는 그 면역학적 활성을 보존할 뿐만 아니라 효소의 활성도 보존한다.측정할 때 피검표본 (그중의 항체 또는 항원을 측정함.) 은 고상담체 표면의 항원 또는 항체와 반응한다.세척 방법으로 고체 캐리어에 형성된 항원 항체 복합체를 액체 속의 다른 물질과 분리시킨다.효소 표시를 넣은 항원이나 항체도 반응을 통해 고체 캐리어에 결합된다.이때 고상상의 효소량과 표본에서 검사받은 물질의 양은 일정한 비례를 보인다.효소반응의 바탕물을 첨가한후 바탕물은 효소에 의해 유색산물로 촉매되는데 산물의 양은 표본에서 검사받은 물질의 량과 직접 관련되기에 색을 나타내는 깊이에 따라 정성 또는 정량분석을 진행할수 있다.효소의 촉매 효율이 높기 때문에 면역 반응의 결과를 간접적으로 확대하여 측정 방법을 매우 높은 민감도에 이르게 한다.

2. ELISA의 유형

ELISA는 항원 측정이나 항체 측정에 사용할 수 있다.이런 측정방법에는 다음과 같은 세가지 필요한 시약이 있다. (1) 고상적인 항균소원 또는 항체, 즉"면역흡착제"(immunosorbent).(2) 효소가 표기된 항원 또는 항체를'결합물'(conjugate)이라고 한다.(3) 효소 반응의 바탕.시약의 출처와 표본의 상황 및 검측의 구체적인 조건에 근거하여 각종 부동한 류형의 검측방법을 설계해낼수 있다.임상 검사를 위한 ELISA는 주로 다음과 같은 유형이 있습니다.

1.쌍항체 협심법 항원 측정

이중항체협심법은 항원 zui를 검사하는데 흔히 사용하는 방법으로서 조작절차는 다음과 같다.

1) 특이성 항체와 고체 캐리어를 결합하여 고체 항체를 형성한다.세탁은 결합되지 않은 항체와 불순물을 제거한다.

2) 검시표본을 추가하여 보온반응한다.표본 속의 항원과 고상항체가 결합하여 고상항원 항체 복합체를 형성한다.세탁은 기타 미결합 물질을 제거합니다.

3) 효소표시항체를 첨가하여 보온반응한다.고상 면역 복합체의 항원은 효소 표적 항체와 결합한다.* 결합되지 않은 효소 표적 항체를 세척한다.이때 고상 캐리어에 있는 효소의 양은 표본에서 검출된 항원의 양과 관련이 있다.

4) 언더레이를 사용하여 색상을 나타냅니다.고체상의 효소는 바탕을 촉매하여 유색 산물이 된다.비색을 통해 표본 중의 항원의 양을 측정하다.

임상검사에서 이 법은 HBsAg, HBeAg, AFP, hCG 등 각종 단백질과 같은 대분자 항원을 검사하는 데 적용된다.검사 대상 항원에 대한 이성 항체만 얻으면 피고체 캐리어와 효소 결합물을 패키지하는 데 사용할 수 있다.례를 들면 항체의 래원이 항혈청이고 포피와 효소표시에 사용되는 항체는 각각 부동한 종속의 동물에서 취한다.례를 들면 단클론항체를 응용할 경우 일반적으로 항원의 부동한 결정클러스터에 대한 두개의 단항을 선택하여 각각 피고상담체와 제조효소결합물을 포장하는데 사용한다.이런 이중점협심법은 아주 높은 특이성을 갖고있을뿐만아니라 검사받은 표본과 효소표항체를 함께 보온반응하여 한걸음한걸음 검사할수 있다.일차법 측정에서 표본에 검사받은 항원의 함량이 매우 높을 때 과량의 항원은 각각 고상항체 및 효소표시항체와 결합되여 더는"협심복합체"를 형성하지 않는다.침전 반응 중 항원 과잉의 후대 현상과 유사한데, 이때 반응 후 발색의 흡광값 (항원 과잉대에 위치) 은 표준 곡선 (항체 과잉대에 위치) 의 어떤 항원 농도의 흡광값과 동일하다. 만약 상법으로 측정한다면 얻은 결과는 실제 함유량보다 낮을 것이다. 이런 현상을 훅 효과 (hookeffect) 라고 한다. 왜냐하면 표준 곡선이 최고봉에 도달한 후 훅 모양으로 구부러지기 때문이다.갈고리 효과가 심할 때는 반응이 발색되지 않아 가짜 음성 결과가 나올 수도 있다.따라서 한걸음법 시약을 사용하여 표본의 함량이 비정상적으로 높아질 수 있는 물질(예를 들어 혈청에서 HBsAg, AFP, 소변 hCG 등)을 측정할 때는 측정 가능한 범위의 zui 높은 값에 주의해야 한다.친화력이 높은 단클론 항체로 이런 시약을 제조하면 갈고리 모양의 효과를 약화시킬 수 있다.만약 측정된 분자의 다른 위치에 HBsAg의 a 결정 클러스터와 같은 여러 개의 동일한 결정 클러스터가 포함되어 있다면, 또한 이 결정에 대한 동일한 단항 분리 패키지 피고체와 제조 효소 결합물을 사용할 수 있다.그러나 HBsAg의 검사에서 아형문제에 주의를 돌려야 한다. HBsAg에는 adr, adw, ayr, ayw 등 4개 아형이 있다. 비록 각 아형은 모두 같은 a가 클러스터의 반응성을 결정하지만 이는 단항으로 협심법을 할 때 주의해야 할 문제이기도 하다.이중 항체 협심법으로 항원을 측정하는 또 다른 주의점은 류머티즘 인자 (RF) 의 간섭이다.RF는 IgM형이 많은 자체 항체로 다양한 동물 IgG의 Fc 세그먼트와 결합할 수 있다.이중 항체 협심법 검사로 사용되는 혈청 표본에 R F가 함유되어 있으면 항원 성분으로 충당할 수 있으며, 동시에 고상 항체와 효소 표적 항체와 결합하여 가짜 양성 반응을 나타낸다.F(ab') 또는 Fab 세그먼트를 효소 결합물로 사용하는 시약은 Fc 세그먼트를 제거하기 때문에 RF의 간섭을 제거합니다.이중 항체 협심법 ELISA 시약이 RF의 영향을 받는지 여부는 이미 이런 시약의 심사 지표로 분류되었다.쌍항체 협심법은 2가 또는 2가 이상의 대분자 항원을 측정하는 데 적용되지만, 반항원 및 소분자 단가 항원을 측정하는 데는 적용되지 않으며, 이는 두 자리 점 협심을 형성할 수 없기 때문이다.

2.이중 항원 협심법 항체 측정

반응 패턴은 쌍항체 협심법과 유사하다.특이성 항원으로 패키징과 제조 효소 결합물을 진행하여 상응하는 항체를 검사한다.간접적으로 항체를 측정하는 것과 다른 점은 효소 항체 대신 효소 항원을 표시하는 것이다.이 법에서 피검표본은 희석할 필요가 없고 직접 측정에 사용할수 있기에 그 민감도는 간접법보다 상대적으로 높다.B형 간염 표지물 중 항HBs의 검사는 항상 이 방법을 채택한다.이 법의 관건은 효소표항원의 제조에 있으며 항원구조에 따라 적합한 표기방법을 찾아야 한다.

3. 간접적으로 항체를 측정한다

간접법은 항체를 검사하는 데 자주 사용하는 방법이다.그 원리는 효소에 표시된 항항체(항인면역글로불린항체)를 이용하여 고상항원과 결합된 피검항체를 검사하는 것이기 때문에 간접법(그림2-3 참조)이라고 한다.작업 단계는 다음과 같습니다.

1) 특이성 항원과 고상 캐리어를 연결하여 고상 항원을 형성한다.세탁은 결합되지 않은 항원 및 불순물을 제거합니다.

2) 희석된 피검혈청, 보온반응.혈청 속의 특이항체는 고상항원과 결합하여 고상항원 항체 복합체를 형성한다.세탁 후 고체 캐리어에는 특이성 항체만 남았고, 혈청의 다른 성분은 세탁 과정에서 씻겨졌다.

3) 효소표항체를 첨가한다.효소 항인 Ig로 총 항체를 검사할 수 있지만, 일반적으로 효소 항인 IgG로 IgG 항체를 검사한다.고상 면역 복합체 중의 항체는 효소 표시 항체 항체와 결합하여 간접적으로 효소를 표시한다.세탁 후, 고체 캐리어의 효소 양은 표본에서 검사 된 항체의 양과 관련이 있습니다.

4) 가저물현색본법은 주로 병원체항체에 대한 검측을 위해 전염병의 진단을 진행하는데 사용된다.

간접법의 장점은 패킷 피항원을 변환하기만 하면 동일한 효소 표적 항체를 이용해 해당 항체를 검사하는 방법을 만들 수 있다는 것이다.간접법 성공의 관건은 항원의 순도에 있다.때로는 조제항원포이불로도 실제적이고 효과적인 결과를 얻을수 있지만 될수록 순화하여 시험의 특이성을 높여야 한다.특히 E.Coli를 공정효소로 하는 재조합항원과 같이 일반적인 건강한 사람의 혈청과 반응할수 있는 불순물을 제거하는데 주의를 돌려야 한다. 례를 들면 E.Coli 성분이 함유되여있어 E.Coli 감염자의 혈액중의 항E.Coli 항체와 반응할수 있다.항원에도 사람의 혈장이나 인체조직에서 온 항원과 같은 효소표시인 Ig와 반응하는 물질이 함유되여서는 안된다. 만약 그중의 Ig를 제거하지 않으면 실험에서도 가양성반응이 발생한다.또 항원에 무관한 단백질이 함유돼 있으면 흡착으로 가방 효과에 영향을 줄 수 있다.간접법의 또 다른 교란 요인은 정상 혈청에 함유된 고농도의 비특이성이다.환자의 혈청에서 검사되는 특이성 IgG는 전체 IgG 중 극히 일부에 불과하다.IgG의 흡착성은 매우 강하여 비특이 IgG는 고상담체에 직접 흡착할수 있으며 때로는 가방의 피항원의 표면에도 흡착할수 있다.그러므로 간접법에서 항원포이불은 일반적으로 무관한 단백질 (예를 들면 우혈청단백질) 으로 다시 한번 포이불하여 고상상의 빈 간격을 페쇄 (blocking) 한다.또 검사 과정에서 표본을 먼저 희석(1:40~1:200)해 지나치게 높은 음성 본저가 결과에 영향을 미치는 판단을 피해야 한다.

4.경쟁법 항체 측정

항원재료중의 교란물질이 쉽게 제거되지 않거나 충분한 순화항원을 쉽게 얻지 못할 경우 이 방법으로 특이성항체를 검사할수 있다.그 원리는 표본중의 항체와 일정량의 효소표항체경쟁과 고상항원의 결합이다.표본에는 항체량이 많을수록 고상에 결합된 효소표시항체가 적기 때문에 양성반응은 음성반응보다 색이 옅다.만약 항원이 순도가 높은 경우, 직접 고체상태로 포장할 수 있다.만약 항원에 교란물질이 있을 경우 직접 포피는 성공하기 어려우므로 포획포획포피법, 즉 먼저 포피와 고상항원에 상응한 항체를 가진후 항원을 첨가하여 고상항원을 형성할수 있다.세척하여 항원의 불순물을 제거한 다음 표본과 효소표시항체를 첨가하여 경쟁결합반응을 진행한다.경쟁법 항체 측정에는 표본과 효소 표적 항체를 고상 항원 경쟁과 결합할 수 있는 다양한 패턴이 있는데, 항HBc ELISA는 일반적으로 이 방법을 사용한다.또 다른 모델은 표본을 항원과 함께 고상항체에 넣어 경쟁적으로 결합하고 세탁한 뒤 효소표시항체를 넣어 고상에 결합된 항원과 반응하는 것이다.HBe에 대한 검사는 일반적으로 이 방법을 사용합니다.

5.경쟁법 항원 측정

소분자 항원이나 반항 원인은 협심법이 될 수 있는 두 개 이상의 위치가 부족하기 때문에 쌍항체 협심법으로 측정할 수 없고 경쟁법 모델을 채택할 수 있다.그 원리는 표본 속의 항원과 일정량의 효소 표적 항원 경쟁과 고상 항체의 결합이다.표본에 항원량의 함량이 많을수록 고상에 결합된 효소표항원이 적고 zui후의 발색도 옅어진다.소분자 호르몬, 약물 등 ELISA 측정에는 이 방법이 많이 쓰인다.

6. 포획 패키지 피법 항체 측정

IgM 항체의 검사는 전염병의 조기 진단에 사용된다.간접법인 ELISA는 일반적으로 총 항체 또는 IgG 항체를 검사하는 데만 적용된다.례를 들면 항원포피의 간접법으로 IgM항체를 직접 측정하면 표본에는 일반적으로 비교적 높은 농도의 IgG항체가 동시에 존재하는데 후자는 경쟁을 고상항원에 결합시켜 일부 IgM항체를 고상에 결합시킬수 없게 한다.따라서 항인 IgM을 2항으로 사용하여 간접적으로 IgM 항체를 측정할 경우, 먼저 표본을 A 단백질 또는 항 IgG 항체로 처리하여 IgG의 간섭을 제거해야 한다.임상검사에서 항체 IgM을 측정할 때는 포획포피법을 많이 사용한다.먼저 항인 IgM 항체 패키지로 고체화되어 혈청 표본의 IgM (항원에 대한 특이성 IgM 항체와 비특이성 IgM 포함) 을 포획한다.그런 다음 특이성 IgM에만 결합하는 항원을 추가합니다.이어 효소를 넣어 항원에 대한 특이성 항체를 표시했다.다시 바탕과 작용하면 색을 나타내면 표본의 IgM과 상관관계가 있다.이 방법은 바이러스성 감염의 조기 진단에 자주 사용된다.A형 간염 바이러스 (HAV) 항체의 검사 패턴은 그림 2-7 참조.류머티즘 인자 (RF) 도 포획 패키지 피법 측정 IgM 항체를 방해하여 가짜 양성 반응을 일으킬 수 있다.이 때문에 IgG를 중화하는 간접법이 최근 인기를 끌고 있다. 이런 시약으로 항CMV IgGM과 항궁형충 IgM 항체를 검사하는 데 성공했다.

7.ABS-ELISA 법

ABS는 친화소(avidin) 바이오틴(biotin) 시스템(system)의 약어다.친화소는 당단백질의 일종으로 분자량이 60000이고 매 분자는 생물소와 결합할수 있는 4개 아기로 구성되였다.바이오매스는 소분자 화합물로 분자량이 244이다.화학적 방법으로 만들어진 유도체인 히드록시 앰플아미드는 단백질과 설탕 등 다양한 종류의 크고 작은 분자와 바이오신 표기 산물을 형성할 수 있어 표기 방법이 꽤 간편하다.생물소와 친화소의 결합은 매우 강한 특이성을 가지고 있으며, 그 친화력은 항원 항체 반응보다 훨씬 크며, 양자는 결합하기만 하면 매우 안정적이다.하나의 친화소는 4개의 바이오매스 분자와 결합할 수 있기 때문에 ABS와 ELISA법을 효소 표기 친화소-바이오매스(LAB)법과 브리지 친화소-바이오매스(ABC)법 두 가지 유형으로 나눌 수 있다.둘 다 기존 ELISA 시스템에서 효소 표시 항체(항원) 대신 바이오매스 표시 항체(또는 항원)를 사용한다.LAB에서 고상생물소는 먼저 표기되지 않은 친화소와 반응한후 효소표기된 생물소를 첨가하여 민감도를 한층 더 높인다.초기에 친화소는 달걀흰자에서 추출되는데 이 란친화소는 알칼리성당단백질로서 폴리스티렌담체와 흡착성이 아주 강하여 ELISA에 사용하면 본바닥을 높일수 있다.스트렙토마이신에서 추출한 스트렙토마이신은 이런 단점이 없어 ELISA 애플리케이션에서 전자를 대체하는 추세다.ABS-ELISA는 일반 ELISA보다 두 가지 시약을 더 사용하고 운용 절차를 추가했기 때문에 임상 검사에서 ABS-ELISA는 많이 적용되지 않았다.