MOC2 세포계

MOC2 세포계

Uppaluri Lab Tissue Culture Protocols for MOC cell lines업데이트 12.12.16

필요한 재료 (IMDM MOC 라인 미디어를 만드는 데 필요한 시약에 대한 IMDM 프로토콜을 참조하십시오)

시그마 알드리치: DMSO: D2650-100ml

FisherScientific의:

T150병 : 07-200-64

T75 병: 10-126-37

Cryovials : 03-374-059

45um 여과기: : 09-754-21

05% 트립신 : sh30236.01

25% 트립신 : sh30042.01

인도렌트 라인 - MOC1, 22

공격적인 선 - MOC2

1. 용해하기 전에 T150에 21ml IMDM MOC 라인 미디어를 추가하십시오 (또는 aT75로 용해하고 싶다면 T75에 10ml)

2. 액체 질소에서 cryovial를 제거하십시오, 그것을 청소하기 위해 70% 알코올을 가진 살포 병.

3. 37Cwaterbath에 있는 cryovial의 하단 절반을 유지하십시오 (오염을 피하기 위해 물물물을 만지지 않도록 오오오염을 피하기 위하여 3 3 3737Cwaterbath에 얼음의 작은 3 얼얼음의 작은 3.

4. ETOH와 함께 다시 cryovial를 분사하고 후드에 있는 장소.세포의 1ml에 미디어의 1ml를 피세세세트하고 이미 미디어를 포함하는 T150에 이러한 2ml를 추가하십시오 (1개의 T150에 대해 22ml의 총을 만들기 위해).

5. T150 플라스크에 있는 미디어를 이미 가져와 당신이 cryovial에 남은 모든 잔류 세포를 가지고 있는지 확인하기 위해 cryovialand 판을 5 5 5 5 5.

냉동 세포 선:

DMSO가 세포에 독성이 있기 때문에 빠르게 작동합니다.

70-80% 세포 합류를 가진 각 T150 플래스크를 위해 3-4 개의 병을 동결하십시오.

1. 아래에서 볼 수 있는 T150에서 수확 세포

2. 15ml 원형 관 (1000 RPM x5 분)에 있는 2 2 2 2 2. 2 2 2 2. 2 2 2 2 2.

3. 초생물을 3. 3.

4. 15ml 원형 관 toresuspend 세포를 누르십시오

5. IMDM MOC 선 매체의 1.5ml를 추가하십시오, 매체에 있는 세포를 재구성하십시오 – 얼음에 유지하십시오

6. 관이 얼음에 있는 동안 1.5 ml의 동결 매체를 천천히 추가하십시오

동결 매체를 만들기 위해 – IMDM MOC 라인 매체에서 20% DMSO.예: 20ml 주식을 위해 - 16ml IMDM MOC 라인 매체와 4ml DMSO를 추가하십시오. .45um 필터를 사용하여 주사기 필터

7. 3개의 cryovials에 각각의 1ml

8. 2 주 이상 -80C에 저장하십시오.

9. 1-2 주 안에 액체 질소로 위치.

참고: 원하는 경우, 4개의 병에 저장하기 위해 2ml IMDM 및 2ml 냉동 매체로 증가할 수 있습니다.또한 세포를 계산하고 세포를 동결하기 전에 병에 기록하는 것이 좋습니다.

MOC2 세포계

세포선 특성:

Indolent - MOC1: in vivo 연구에 따라 적은 공격성.80% 합류 T150에서 1:12를 통과하면 80% 합류에 도달하는 데 2-4 일이 걸립니다.MOC1 세포선은 더 공격적인 세포선에 비해 수확될 때 플래스크에서 나오는 데 더 오래 걸립니다.

Aggressive - MOC2: in vivo 연구에 따라 더 공격적입니다.80% 합류에서 1:12를 통과하는 경우

T150, 80% 합류에 도달하기 위해 2-4 일이 걸립니다.공격적인 세포선은 공용적인 세포선에 비해 훨씬 쉽게 플래스크에서 나옵니다.

T150에서 세포를 수확하고 전달, 80% 합류:

1. T150에서 매체를 1. 1 1. 1 1 1 1. 1 1 1 1 1. 1 1 1 1. 1 1 1 1.

2. 10-20ml PBS로 한 번 세우십시오.PBS 세척.

3. 1.5ml 0.05% 트립신을 추가하십시오, 트립신이 전체 표면 면적을 커버하고 따라서 모든 세포를 만지는 것을 확인하기 위해 트트트3 3 3 3.5ml 0.5ml 0.05% 트립신을 추가하십시오 (세포가 너무 오래 트립신에 노출되지 않도록 이것을 빨리 하십시오), 트립신을 3 트트트트립신을 3 1 3.

4. 37C incubator에 위치.공격적 인 세포 선을 위해 3-4 분 동안 적적성화 하 고 10-12 분까지 걸릴 수 있지만 6-8 분 후에 확인.

5. 세포를 5 번 5. 손5 5. 세포를 5 5 손5 5 5. 세포를 5 5 5. 손5 5 5. 세포를 5 5 5 세포를 5 5 5.

6. 세포가 매체에서 자유롭게 부동한지 확인하기 위해 현미경 아래에서 확인하십시오.대부분이 아니라면 3-5 분 동안 37C 인대대베이터에 다시 넣으십시오.세포가 트립신에 너무 오래 앉아있도록 하지 않도록 노력하십시오.

7. 세포의 모든 또는 대부분이 부동되면, 반응을 중화하기 위해 IMDM MOC 선 매체의 10ml를 추가하십시오.

8. 피15 ml 8. 8. 피8 8 피8 8. 피8 8 8. 8 8 8 8. 피8 8 8 8. 피8 8 8 8. 피8 8 8 8 8 8 피8 8 8 8 8 피8 8 8 8 8 8. 피8 8 8. 피8 8 8 8. 8 8 8 피8 8 8 8 81000 RPM x 5 분에서 원심

9. 초생물을 9.

10. 1:12에서 세포를 통과하기 위해 - 미디어의 또 다른 12 ml에서 세포를 다시 10 10 10.

11. IMDM MOC 선 매체 (1:12 희석)의 22ml의 총 양을 가진 새로운 T150 플래스크에 이것에서 1ml를 가져가십시오.

12. 성장하기 위하여 37C 인쿠베이터로 다시 배치하십시오.2-4 일 안에 80% 합류에 도달해야합니다.

마우스의 flank에 주입 (heterotopic):

필요한 세포 농도:

MOC1, MOC22: (0.15ml에 있는 1e6 세포를 주입하십시오) = 6.66e6 세포/ml MOC2: (0.15ml에 있는 1e5 세포를 주입하십시오) = 6.66e5 세포/ml

1. 위에 언급된 0.25% 트립신을 가진 수확 세포.

2. IMDM MOC 선 매체를 가진 트립신을 중화 한 후, 세포를 50ml 5050ml 원2 5050ml 2 2 2 50ml 원2 2 2 2. 50ml 2 2 2 2. 50ml 원2. 세2. 50ml 2. (참고: 소형 게이지 바늘을 허용하기 위해 50ml 원형을 사용하여 세포를 그리십시오

주입.

3. 얼음 차가운 PBS (가능한 한 FCS를 포함하는 매체를 제거하도록 확인) 10ml에 있는 세포 세세세세포 세세세세포 3 3 세세세세포 3 3 세세세세포 3 세세세포함 세포 3. 세포 3. 세세포를 다시 세포를 다시

4. 얼음 냉각 PBS의 3-6 ml에 있는 세포 세세세포 4 세세포 4 4 4. 세포를 다시 세포 4 4 4. 세포 4 4 4 세세세포 4 4 4 4. 세세포 4. 세세세포를 다시 세포 4. 세포를 다시 4 세

5. 세포 카운터, trypan 파랑을 사용하여 hemocytometer 또는 자동화 cellsperml를 사용하여, 세계

죽은 세포를 제거합니다.존재하는 전체 세포 수 (세포/ml x PBS의 전체 ml)를 사용하여 세포 세세세포 세세세세포 세세세세포 세세세세세세포 세세세세세세세포 세세세세세포 세세세세세포 세세세세포 세세세세세세포 세세세세세세세포

예를 들어, MOC1의 세포 수는 2.8e6 세포/ml x 5ml (PBS) = 14e6 세포 총입니다.14e6 세포 / 6.66e6 세포/ml = 세포 세세세포 세세세포 세세세포 세세세세포 세세세세포 세세세세세포 세세세세세세포 세세세세포 세세세

6. 다시 세포를 6. 6 6. 6 6 6.PBS 초생물 (피피트피트로 흡수 없이)를 PBS 초생물을 PBS PBS supernatant (pipette with pipette without aspiration)적절한 도달하기 위해 필요한 얼음 냉각 PBS의 계산된 양에 적적적적절한 적절한 도달하기 위해 필요한 적적절한 액량에 적적적적적적절한 적적적절한 도

초생물을 초생물을 초생물을 초초생물을 초초생물을 초생초생물을 초생물을 농도초생물을 초워초생물을 초우초생물을 초우초생물을 초우초생물을 초우초생물을

7. 얼음에 있는 50ml 원형을 이동하고 피하 측면에 있는 마우스 당 세포의 0.15ml (150ul)를 주입합니다.

8. 표준 프로토콜 당 마우스를 주입하십시오.1ml 주사기를 사용합니다.우리는 1.5 인치 21 게이지 바늘을 사용하여 세포를 그리고 주입하기 위해 ½ 인치 26 게이지 바늘로 바늘을 전환합니다.

1L 미디어용 프로토콜